De Niro hadde småroller innen film fra 1965 og spilte også teater Off-Broadway. Han ble lagt merke til i Martin Scorseses Mean Streets (1973), noe som ble begynnelsen på et mangeårig samarbeid. Han slo gjennom som den unge Vito Corleone i The Godfather Part II (Gudfaren del II, 1975, Oscar for beste birolle) og gjorde en intens rolleprestasjon som den isolerte og avstumpede drosjesjåføren Travis Bickle i Scorseses Taxi Driver (1976; Oscar-nominasjon).

I de neste årene spilte han godseiersønn i Novecento (Nittenhundre, 1976), filmprodusent i The Last Tycoon (Den siste magnat, 1976), vietnamsoldat i The Deer Hunter (Hjortejegeren, 1978; Oscar-nominasjon), et svært overbevisende portrett av bokseren Jake LaMotta i Raging Bull (Den rasende oksen, 1980; Oscar-pris og Golden Globe) og jesuittisk konvertitt i Roland Joffés The Mission (1986).

Fra 1980-årene ble De Niro leverandør av en lang rekke gangster-portretter i filmer som Sergio Leones Once Upon a Time in America (Ondt blod i Amerika, 1983), The Untouchables (De ubestikkelige, 1987; som Al Capone), Goodfellas (Mafiabrødre, 1990) og Casino (1995). Han dukket også opp i nyinnspillingen av thrilleren Cape Fear (1991; Oscar-nominasjon), spilte mot Al Pacino i Michael Manns Heat (1995), var hasjrøykende boms i Quentin Tarantinos Jackie Brown (1997) og mentalt ustabil mafiasjef i komedien Analyze This (1999; oppfølger 2002).

Innimellom var han en innpåsliten komikerspire i The King of Comedy (1983), pasient i Awakenings (Oppvåkningen, 1990; Oscar-nominasjon), forelsket politifotograf i Mad Dog & Glory (1993), brutal far i This Boy's Life (Et gutteliv, 1993) og monsteret i Kenneth Branaghs Mary Shelley's Frankenstein (1994).

Fra 2000-tallet gjorde han et stort antall varierte roller, mange i filmer som fikk dårlig mottakelse av kritikerne. Hederlige unntak var blant annet Everybody's Fine (2009), Silver Linings Playbook (Kjærlighetens galskap, 2012; Oscar-nominasjon), The Intern (2015) og dramaet Killers of the Flower Moon (2023), hvor han nok en gang samarbeidet med Martin Scorsese og ble Oscar-nominert for beste birolle.

De Niro regidebuterte med A Bronx Tale (Gudfarens løpegutt, 1993; også rolle), og har siden laget The Good Shepherd (Den innerste sirkel, 2006; Gullbjørnen-nominasjon; også rolle) med Matt Damon, som forteller en CIA-agents historie med utgangspunkt i Cubakrisen. Som en av produsentene for Scorseses The Irishman (2019) fikk han en Oscar-nominasjon for beste film og spilte i tillegg hovedrollen som irsk fagforeningsleder.

I 2002 var han med på å etablere filmfestivalen TriBeCa på Manhattan.

• Film i USA
• filmens historie
• Martin Scorsese
• Hollywood
• Oscar – filmpris