Louis Pasteur startet sin vitenskapelige karriere med å undersøke krystaller av vinsyre (tartarsyre). Vinsyre er et biprodukt ved produksjon av vin og danner hvite krystaller på bunnen av flasker og fat. Han undersøkte krystallene i detalj blant annet med mikroskop og oppdaget fenomenet kiralitet, som betyr at noen organiske molekyler finnes i to ulike former som er speilbilder av hverandre og har ulike egenskaper. Spesielt for dem er at de er optisk isomere og dreier polarisert lys i hver sin retning: til høyre eller til venstre. Oppdagelse av dette fenomenet har fått stor praktisk betydning innenfor stereokjemi.

I tiden omkring 1850 var det en vanlig oppfatning at alkoholgjæring (fermentering) var en rent kjemisk prosess, og at de strukturene man så i mikroskopet i ølbrygg og vin var kjemiske biprodukter ved gjæringen. Pasteur var imidlertid overbevist om at gjæringer og forråtnelse var forårsaket av levende organismer. Dette fikk han anledning til å undersøke da han i 1857 ble tilkalt til vinprodusentene Lille som hadde store problemer med at vinen de produserte ble sur. Når han undersøkte den sure vinen i mikroskop, fant Pasteur raskt ut at de strukturen han antok var gjærceller i normal vin, var erstattet av bakterier i den sure vinen. Han fant at årsaken til den sure smaken var melkesyre, og foreslo at bakterier som var til stede omdannet sukkeret i druene til melkesyre ved melkesyregjæring. At det var dette som var tilfelle viste han gjennom en rekke laboratorieforsøk.

I tillegg til melkesyregjæring og alkoholgjæring oppdaget Pasteur også smørsyregjæring og eddiksyregjæring. Han isolerte og beskrev også de spesifikke bakteriene som forårsaket de ulike gjæringene.

For å hindre at vinproduksjonen ble ødelagt av uønskede bakterier foreslo Pasteur at materialet som skulle bli til vin eller øl ble varmet opp til 55-60 °C. Dette ble kalt pasteurisering og brukes fortsatt i dag for å drepe bakterier, særlig i produksjon av melk og melkeprodukter.

I forbindelse med undersøkelsene av smørsyregjæring, oppdaget Pasteur også et helt nytt fenomen; at det finnes mikroorganismer som lever helt uten tilgang på oksygen. Han innførte begrepene aerob og anaerob for å beskrive henholdsvis liv med og uten oksygen.

I forbindelse med arbeidet med gjæringer kom Louis Pasteur på tanken at det kunne være en direkte sammenheng mellom bestemte mikroorganismer og bestemte sykdommer hos mennesker og andre dyr.

Dette førte til at han begynte å undersøke miltbrann (antrax), som på den tiden var en alvorlig og utbredt sykdom, særlig hos storfe. Han fant at miltbrann var forårsaket av en bestemt bakterie, som nå har navnet Bacillus anthracis. Den tyske mikrobiologen Robert Koch (1843-1910) fant dette samtidig. Dette var begynnelsen på en rekke oppdagelser om sammenhengen mellom bestemte bakterier og bestemte sykdommer.

Louis Pasteur undersøkte også andre sykdommer hos dyr, blant annet hønsekolera, en alvorlig, dødelig sykdom hos kyllinger. Han isolerte og dyrket bakterien (Pasteurella multocida) som er ansvarlig for sykdommen og gjorde forsøk på laboratoriet der han infiserte kyllinger med bakterien. Han oppdaget ved et tilfelle at bakterier som hadde vært oppbevart i lang tid på laboratoriet ikke lenger ga sykdom hos kyllingene. Videre oppdaget han at hvis han etterpå infiserte de samme kyllingene med nydyrkede bakterier, ble ikke kyllingene syke. Pasteur forsto da at de «gamle» bakteriene på en eller annen måte var blitt svekket slik at de ikke lenger førte til sykdom, men at de likevel gjorde kyllingene immune mot sykdommen. Dette var begynnelsen på utviklingen av vaksiner.

Når det gjelder vaksine, er Louis Pasteur mest kjent for sin vaksine mot rabies (hundegalskap), en dødelig, nevrologisk sykdom som finnes både hos dyr og mennesker. Sykdommen har et skremmende forløp både hos mennesker og dyr og var tidligere svært fryktet. Smittestoffet er et virus, men det visste ikke Pasteur.

For å produsere vaksine mot rabies brukte Pasteur kaniner som forsøksdyr. Han varmebehandlet nervevev fra kaniner som hadde dødd av rabies og injiserte dette gjentatte ganger i kaniner, som dermed ble immune.

Vaksinen mot rabies ble brukt første gang på mennesker i 1885 på en liten gutt i Frankrike. Gutten, Joseph Meister, var bitt gjentatte ganger av en hund med rabies og sto i fare for å dø. Pasteur ble overtalt til å vaksinere gutten, og etter 10 dager med 12 injeksjoner ble gutten helt frisk, vokste opp og levde til 1940.

Dette fikk enorm oppmerksomhet, Louis Pasteur ble berømt og Pasteur-instituttet i Paris ble etablert.

Gjennom tidene var det lenge en vanlig oppfatning at liv kan oppstå av seg selv, spontant. Når for eksempel mat blir stående og råtne, vil det etter hvert være store mengder av bakterier til stede, Spørsmålet var hvor de kom fra. Oppsto de spontant, eller kom de utenfra fra luften? Diskusjonen om spontan generasjon var diskusjonstema blant mange vitenskapsmenn i lange tider.

Lous Pasteur var en sterk motstander av teorien om spontan generasjon. Han gikk ut fra at mikroorganismene i råtnet mat kom fra organismer som allerede var tilstede i maten, eller fra luften. For å vise dette utførte han flere viktige forsøk. Han presset store mengder luft gjennom et filter av nitrocellulose, og da han undersøkte filteret etterpå fant han de samme bakteriene som er i råtten mat.

I 1864 utførte han sitt berømte forsøk med «svanehals-kolber». Dette er glasskolber hvor halsen er bøyd på en slik måte (som halsen til en svane) at mikroorganismer ikke kan komme gjennom. Han fylte kolbene med næringsmedium og kokte dem slik at forholdene ble sterile. Deretter fikk de stå. Så lenge halsen var bøyd ble næringsmediet ikke forurenset av mikroorganismer. Hvis «svanehalsen» ble brukket, ble væsken raskt forurenset. Det samme skjedde hvis kolben ble bøyd slik at væsken kom i kontakt med luft.

Disse enkle, elegante forsøkene motbeviste teorien om spontan generasjon.

Silkestoff er vevet av silkefibre som silkeormen produserer når den danner en kokong. Silkeormen er larvestadiet til et insekt, silkespinneren, og utvikler seg fra egg som hunnene produserer.

Silkeproduksjon var en meget viktig industri i Sør-Frankrike tidligere, men på Pasteurs tid fikk denne industrien store problemer. Årsaken var at eggene fra silkespinnerhunnene ikke utviklet seg til larver og dermed ble det heller ikke produsert silkefibre. Pasteur ble tilkalt for å undersøke saken og fant at noen av silkespinnerhunnene var infisert av en mikroorganisme som ble overført til eggene. Eggene ble skadet og utviklet seg ikke til larver. Løsningen på problemet var å undersøke hunndyrene nøye og finne fram til hunnindivider som var fri for den skadelige mikroorganismen og derfor ikke kunne overføre sykdommen til eggene.